歯学ジャーナル
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概要

熱変性後およびコンタクトレンズ抽出物中のリゾチームを評価するための増幅クロマトグラフィー信号とUV吸光分光法

クロード・J・ジャッソン、ダニエル・ベーランド、ランジス・ミショー

目的:高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) で測定したコンタクト レンズから抽出されたリゾチームに関連する吸光度信号を増幅し、リゾチームの純度と、熱変性がその溶出プロファイルにどの程度影響するかを調べます。
方法:コンタクト レンズ抽出物をシステムに注入してクロマトグラフィーを試行したところ、4 分から 5.5 分の間に収集された画分は、ウェスタン ブロットで示されたように、溶出タンパク質としてリゾチームを示しました。タンパク質は、0.2% トリフルオロ酢酸 (TFA): アセトニトリル (ACN) の 50:50 溶液でコンタクト レンズから抽出されました。各コンタクト レンズ抽出物は 2 つのアリコートに分けられました。真空蒸発後、アリコート 1 は最初の移動相に溶解され、濃縮係数 8 が生成されました。アリコート 2 は、通常の抽出溶液に未処理のまま残されました。 220 nm での吸光度信号の較正により、クロマトグラムでリゾチーム レベルを測定できました。両方のアリコートを HPLC に並行して注入することで、リゾチーム含有量を比較できました。抽出されたリゾチームの純度は、ピーク間の吸光度スペクトルを表示することで評価しました。あらかじめ 80 および 100 °C に加熱したリゾチーム溶液を注入し、コントロール溶液と比較しました。アリコート 1 と 2 の間のリゾチーム含有量の中央値の違い、およびコントロールと比較した加熱リゾチームのピーク面積の違いは、ノンパラメトリック法でテストされました。
結果:濃縮抽出物と通常抽出物で測定されたリゾチーム レベルの中央値は大幅に異なりました (それぞれ 39.8 および 21.5 μg)。ただし、異なる注入量と濃縮係数について補正すると、濃縮リゾチームの平均レベル (21.4 μg) は通常抽出物で検出されたレベルに近くなりました。スペクトル吸収の観察から、溶出リゾチームには汚染物質がないことが示唆されます。加熱リゾチームのピーク面積とコントロール リゾチームのピーク面積の比率の中央値は、符号付き順位検定で 100°C の温度では 1 と有意に異なりましたが (0.91)、80°C の温度では 1 と有意に異なりませんでした (0.95)。80°C で加熱した場合でも、リゾチームの溶出プロファイルはコントロールに比べて対称性が低く、追加の変曲点を示しました。これらの微妙な変化は 100°C で増加しました。
結論:コンタクト レンズから抽出され、最初の移動相に溶解されたリゾチームを濃縮すると、このクロマトグラフィー手順の感度が向上します。UV 吸光分光法と組み合わせたこのクロマトグラフィー プロトコルは、80°C と 100°C での熱変性を検出できます。