プロバイオティクスと健康に関するジャーナル
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概要

蛍光染色と蛍光顕微鏡によるプロバイオティクスLactobacillus acidophilusの細胞壁の完全性とプロトプラスト形成

ライアン・ペイジ、デヴィッド・バーク、カヤヌシュ・アリアナ

細菌細胞のプロトプラストの識別には、これまで位相差顕微鏡法が利用されてきました。この方法では、サイズと形状の変化によってプロトプラストを判別します。特定の細胞成分を標的とする蛍光染色法を利用すると、より検証可能な方法を使用できます。この研究の目的は、細胞壁消化酵素にさらした後、プロバイオティクスLactobacillus acidophilusにおける細菌細胞壁の有無を蛍光顕微鏡法で判別することです。細菌細胞を異なる濃度のリゾチーム [0、175、250、425 μg/ml] で処理し、37°C​​ で 10 分間培養しました。リゾチーム処理後、細胞は異なる濃度 (1 倍、2 倍、10 倍、100 倍) の小麦胚芽凝集素 (WGA) と Hoechst 33342 の 2 つの蛍光染料で蛍光染色されました。WGA [CF ^® 594 WGA、赤色蛍光染料] は細胞壁のペプチドグリカン層の残基に選択的に結合するために使用され、青色蛍光染料 Hoechst 33342 は細菌細胞の二本鎖 DNA の核酸に特異的に結合するために使用されました。蛍光顕微鏡検査用のサンプル調製の標準方法に従いました。各リゾチームと染料の組み合わせについて 3 つの視野を調査しました。リゾチーム濃度の差を判断するために一元配置分散分析を実行しました。p 値 < 0.05 は有意差があると記録されました。細胞壁の構造的完全性は、リゾチーム濃度が 175 および 250 μg/ml で劣化し始め、濃度が 425 μg/ml になると細胞溶解と DNA の条線が増加しました。リゾチーム濃度 175 μg/ml では、平均 41% のプロトプラストまたは細胞壁の部分消化が発生しました。リゾチーム濃度を 175 から 250 μg/ml に上げると、プロトプラストの平均割合が減少しました (4%)。濃度 425 μg/ml では、プロトプラストの平均割合は 1% に減少し、DNA の条線も増加しました。1 倍の染料濃度では、細胞壁の部分的な染色が観察されました。2 倍では、細胞壁の完全な染色が記録されました。10 倍では、2 倍の染料濃度と同様に細胞壁と核の完全な染色が観察されましたが、染料の顕著な飽和は見られませんでした。 100 倍の染料濃度では、細胞壁と核の染料が過飽和状態になり、それらが混ざり合って細菌細胞とプロトプラストの識別効果が阻害されます。細胞壁と核を完全に染色するには 2 倍が最適です。染料の濃度が上がると、バックグラウンドの蛍光ノイズが観察されました。Lactobacillus acidophilusでは、細胞壁の消化には 175 μg/ml のリゾチーム濃度で十分でした。染料濃度の有効性は 2 倍で最高となり、バックグラウンド ノイズは最小限でした。