応用薬学ジャーナル
オープンアクセス

概要

遺伝子組み換え Cyt b5-CYP3A4 融合タンパク質と POR の Sf9 昆虫細胞における共発現と in vitro での発現産物の機能特性評価

Zhangming Xie、Shabbir Ahmed、Wenhui Liu、Sisi Kong、Yingchun Xu、Ting Liu、Shuqing Chen

ヒトシトクロム P450 3A4 (CYP3A4) は肝臓で最も豊富な第 I 相薬物代謝酵素であり、市販されている薬物の約 50% が CYP3A4 によって代謝されます。そのため、多くの in vitro 研究では、in vivo での潜在的な薬物間相互作用 (DDI) を評価するためのスクリーニング ツールとして、組み換え CYP3A4 に依存してきました。しかし、高い触媒活性を持つ組み換え CYP3A4 に関する情報は限られています。そこで、本研究では、高い触媒活性を持つ組み換え CYP3A4 を取得し、in vitro でその機能を特徴付けることを目的としました。異種発現した CYP3A4 の触媒活性を強化するために、酵素をシトクロム b5 (b5) の尾から頭に融合し、融合酵素を NADPH-P450 還元酵素 (POR) とともに単一のプラスミドに挿入して、sf9 細胞での同時発現を実現しました。ここでは、融合酵素の基質結合親和性、酵素活性、およびin vitro DDIにおける応用について調査しました。POR-cyt b5CYP3A4の解離定数Kdは8.3 ± 0.87 μmol/L、Clint（Clint = Vmax / Km）は、テストステロン代謝におけるPOR-cyt b5CYP3A4の場合は8.57 mL/分/gタンパク質、ミダゾラムの場合は150.3 mL/分/gタンパク質でした。さらに、ケトコナゾールのテストステロン代謝に対する阻害定数Kiは0.013 ± 0.0038 μmol/Lでした。今回の結果は、融合酵素の基質結合親和性と酵素活性が大幅に増加したことを示唆しています。したがって、この構築物は、in vitroでのCYP3A4に関連する薬物代謝とDDI調査の研究に役立つ可能性があります。さらに、融合酵素と POR を同時に発現させることで、CYP3A4/POR/b5 のより安定したモル比に基づいて、より再現性の高い結果が得られる可能性があります。