熱力学と触媒のジャーナル
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概要

マイナーグルーブインターカレーションループの疎水性の低下は、大西洋タラ由来の寒冷適応ウラシル-DNA N-グリコシラーゼによる効率的な触媒作用に重要である

エリン・モー、ネサネット・ギザウ・アセファ、インガー・レイロス、キャスリン・トルセス、アルネ・オ・スマロース、ニルス・ペダー・ウィラッセン

ウラシル-DNA N-グリコシラーゼ (UNG) のマイナーグルーブ挿入ループ (ロイシンループ) は、基質との相互作用により大幅な構造変化を起こします。これまでの研究で、寒冷に適応した大西洋タラの UNG (cUNG) は、ヒト UNG (hUNG) よりも 10 倍高い触媒効率を持つことが示されています。2 つの酵素の配列アライメントにより、cUNG のロイシンループ内およびその付近でアミノ酸置換が明らかになりました。これによりループの弾性が高まり、hUNG と比較して cUNG の触媒効率が高くなる理由が説明できます。この仮説を調査するために、タラからヒト UNG への置換を持つ cUNG の単一変異体 5 個と多重変異体 4 個を構築し、3 つの異なる温度 (15、22、37°C​​) での速度論実験と示差走査熱量測定 (DSC) によって特性評価を行いました。結果は、変異が KM よりも kcat に影響を及ぼし、明らかに疎水性が低下した変異体 (A266T、V267A、A266T/V267A、A266T/V267A/A274V) は cUNG と比較して kcat が増加するか同等であるのに対し、疎水性が増加すると予測された変異体 (A274V、H275Y、L279F、A266T/V267A/A274V/H275Y、A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q) は cUNG と比較して kcat が減少したことを示しました。したがって、hUNG のロイシン ループのアミノ酸組成を模倣すると、cUNG の活性が低下します。 DSC 実験は、ロイシン ループの疎水性の変化の結果として変異体の全体的な安定性が増加する可能性を特定するために実施されました。しかし、結果は、kcat が増加した変異体では全体的な安定性がわずかに低下し、kcat が減少した変異体では安定性が上昇したことを示しました。これらの結果は、アミノ酸置換によって導入されたロイシン ループの弾性の増加/減少の可能性を補う必要があることから生じたと考えられます。この研究は、UNG の効率的な触媒作用におけるロイシン ループの重要性を確認し、このループのアミノ酸組成を操作することでこの酵素の触媒能力を変更できることを示しています。