歯学ジャーナル
オープンアクセス

概要

網膜の新規遺伝子、ホスホリパーゼドメイン含有2（Pnpla2）の選択的スプライシング変異体の探索

ジャクリーン・タレア・デジャルダン、S・パトリシア・ベセラ、プリティ・スブラマニアン

目的: Ensembl およびその他の発現配列タグ (EST) データベースは、マウスおよびラットにおける、色素上皮由来因子受容体 (PEDF-R) をコードする遺伝子Pnpla2の推定選択的スプライスバリアントを明らかにしました。本研究の目的は、マウスにおけるPnpla2スプライスバリアントの実験的証拠を得ることです。

材料と方法:光受容体由来のマウス細胞株 (661W 細胞) とマウスの眼、心臓、脂肪、腎臓、および肝臓組織を培養したものを使用しました。細胞と組織からメッセンジャー RNA (mRNA) を単離し、相補 DNA (cDNA) を合成しました。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プライマーペアは、推定スプライス部位を挟むように設計しました。エクソン排除リアルタイム PCR を使用して、全長Pnpla2転写産物の増幅を減らし、少量のスプライスバリアントの増幅を高めました。PCR 産物はアガロースゲル電気泳動で分離し、UV トランスイルミネーターで検出しました。ヒト全長PNPLA2 cDNA またはエクソン 5b (E5b) を欠くPNPLA2 cDNA を含む組み換えプラスミドを、この手法を検証するためのコントロールとして使用しました。661W 細胞から全細胞溶解物を調製しました。PEDF-R タンパク質検出はウェスタンブロットを使用して行いました。

結果: 661W 細胞またはさまざまなマウス組織から得られたPnpla2転写産物の PCR 産物は、複数のプライマー ペアで増幅した後、単一のバンドに分解されました。さまざまなモル比で 2 つの PNPLA2 cDNA を同時に増幅すると、より少ない量の転写産物の検出を防止できました。ただし、エクソン排除法を使用して全長Pnpla2転写産物の cDNA を大幅に排除した場合でも、 Pnpla2スプライス バリアントに対応するバンドは検出されませんでした。それでも、2 つの異なる抗体を使用した 661W 細胞溶解物全体のウェスタン ブロットでは、PEDF-R タンパク質のアイソフォームが明らかになりました。

結論:データは、翻訳後処理を受ける単一のタンパク質産物を生成する可能性のある単一の完全長Pnpla2転写産物の存在の証拠を提供します。