人類学
オープンアクセス

概要

BNAClamp リアルタイム PCR を用いた上皮成長因子受容体 T790M の高感度検出

オースティン ディンケル、レイチェル A. ホフマイスター、アンドリュー ハッケルビー、アーロン S. カストロ、ミゲル M. カストロ、ソングン キム*

上皮成長因子受容体（EGFR）の変異は、乳がんや肺がんなどさまざまながんの原因となります。EGFRのチロシンキナーゼドメインの単一変異T790Mは、抗がん剤ゲフィチニブに対する反応を示し、そのような薬剤に対する耐性の発現につながります。したがって、この変異を検出することで、抗がん剤治療を必要とする患者に効果的な治療オプションを提供できます。私たちは、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション親和性を高めることが知られている架橋核酸（BNA）を使用して、T790M変異の簡便で迅速な検出方法の開発を目指しました。BNA塩基を含むオリゴヌクレオチドは、野生型遺伝子に対するPCR反応をブロックするように設計されており、多数の野生型遺伝子と混在する変異遺伝子の存在を識別するために使用されました。 BNA クランプと組み合わせたリアルタイム PCR により、野生型遺伝子と変異遺伝子の比率に応じて異なる程度の PCR 増幅を観察できます。その可能性を探るために、さまざまな数の BNA 塩基を含む 13 マーオリゴヌクレオチドクランプをいくつか作成しました。Tm 値分析では、9 つ​​の BNA 塩基を含むクランプ (BNA クランプ 9) が野生型遺伝子と変異遺伝子を区別するのに最も効果的であることが示唆され、BNA クランプ 9 を使用した感度テストでは、クランプが野生型遺伝子の T790M 変異の 0.1% 以下を検出する能力があることが明らかになりました。さらに、分子動力学 (MD) シミュレーションによって結合構造が分析され、BNA クランプ 9 が元々構築された BDNA 構造を歪めることが明らかになりました。さらに、アンブレラサンプリングにより、野生型では -60 kJ/mol、変異遺伝子では -40 kJ/mol の結合自由エネルギーが得られました。このBNAクランプとリアルタイムPCR技術は、将来的に臨床的に重要な変異を検出するための有望な手段となる可能性がある。