医学診断法ジャーナル
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概要

精子特異的2段階色素排除アッセイによる血漿および細胞小器官膜の完全性の評価 - 細胞質内精子注入のための精子の品質保証のための新しいアプローチ

金子悟、岡田有希、高松聖

目的:血漿膜と細胞小器官膜の包括的な評価は、ヒト精子の受胎能力を理解するための新しいアプローチです。本研究では、ヒト精子の血漿膜と細胞小器官膜を評価するために、精子特異的な 2 段階色素排除アッセイを 2 種類開発しました。

方法:精子特異的 2 段階色素排除アッセイ: 精子を等張培地でリアクティブ レッド 195 (RR195) または Cy3 結合コンカナバリン A (Cy3-con A) とともにインキュベートし、メタノールで細胞膜を排除した後、それぞれリアクティブ ブルー 222 または Alexa 488 結合コンカナバリン A で対比染色しました。ミトコンドリアの細胞小器官膜の完全性は、Mito Tracker FM の保持によって観察されました。cellROX Orange は、反応した活性酸素種による酸化によりオレンジ色の蛍光を発しました。

結果：精子特異的2段階色素排除アッセイは、損傷した細胞膜および器官膜を介した第1の色素の核への浸透および結合から構成され、膜排除後、新たに露出した核または内側の先体膜を第2の色素で対比染色した。ヒト運動精子（生精子；LS）の細胞膜および先体膜の無傷なものはRR195およびCy3-con Aを排除したが、変性したものは浸透を許容した。LSは青に着色または緑色蛍光を発し、一方、変性したものはそれぞれ赤色または赤色蛍光を発した。ミトコンドリア内のMito Tracker FMおよびcellROX Orangeの蛍光は、無傷の器官膜を持つミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の正常性を証明した。派生的な1段階RR195排除アッセイは、臨床ICSIにおける運動精子の術中非破壊評価の有望な候補である。

結論:色素排除アッセイと保持アッセイは、精子の質の術前評価に役立ち、改良されたシングルステップ色素排除アッセイは、臨床的な細胞質内精子注入における術中の精子選択にそれぞれ役立つ可能性がある。