アルコール依存症と薬物依存のジャーナル
オープンアクセス

概要

生体内での β1 アドレナリン受容体のリン酸化状態を決定するための戦略

林耕三、小林弘幸

G タンパク質共役受容体 (GPCR) スーパーファミリーのメンバーである β1 アドレナリン受容体 (Adrb1) は、心臓機能の重要な制御因子です。すべての GPCR は複数の部位でリン酸化され、リン酸化の特定のパターンは、受容体機能と下流の生理学的プロセスを組織特異的に制御するための「バーコード」として機能します。しかし、特異的抗体がないため、生体内での Adrb1 リン酸化部位の位置と機能についてはほとんどわかっていません。生体内のマウス心臓における Adrb1 のリン酸化状態と関連機能を特定するための第一歩として、私たちは次の実験戦略を開発しました。1) 高度なリン酸化プロテオミクス技術を使用して、単離灌流マウス心臓におけるアゴニスト依存性 Adrb1 リン酸化部位を特定します。2) Adrb1 を過剰発現する HEK 293T 細胞から得られた高品質の質量分析 (MS) データによってこれらのリン酸化部位を明確に割り当てます。 3) 生体内のリン酸化状態を明らかにするために免疫親和性精製用にN末端にFLAGタグを融合したAdrb1を発現するノックイン（KI）マウスの生成、4) リン酸化ペプチドと対応する非リン酸化ペプチドイオン強度比のMS測定によるKIマウス心臓のAdrb1の特定部位のリン酸化レベルの解明。この戦略を使用して、灌流マウス心臓のアゴニスト依存性リン酸化部位として、Adrb1のC末端のSer462を特定しました。また、KIマウスのSer274（0.25）、Ser417（0.55）、およびSer462（0.0023）の基底リン酸化比も明らかにしました。これらの発見は、部位特異的リン酸化によって媒介されるAdrb1機能の調節メカニズムに関する新たな洞察を提供します。