ジャーナル オブ ファーマシューティカル ケア & ヘルス システム
オープンアクセス
ISSN: 2376-0419
ISSN: 2376-0419
モハメッド・A・オベイド
RNA干渉は、短い干渉RNA（siRNA）の組み込みによる標的メッセンジャーRNAの分解を伴う[1]。RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNA（dsRNA）が相補的なmRNAを標的として分解することで遺伝子サイレンシングを促進する最も一般的な生物学的ツールであり、疾患の普遍的な治療における大きな革新であり、研究者が遺伝子機能を研究する方法を変革しています。内因性RNA干渉の原子レベル以下の要素に関する情報を拡大するsiRNAは、がんなどの致命的な疾患の治療のための革新的な核酸腐食剤として開発されてきました。
低分子干渉RNA（siRNA）は、19～23ヌクレオチド長の二重結合RNA分子です。これらは、分子生物学において、標的の転写産物を一時的に抑制するために日常的に使用されています。siRNAは、配列の相補性に基づいて、標的の転写産物に結合した後にRNAi反応を引き起こします。siRNAは、さまざまな発がん性lncRNAの阻害による影響を研究するために広く使用されています。
siRNA は、がんなどの以前は重篤だった疾患を治療する革新的な医薬品の開発に新たな可能性をもたらしました。siRNA は内因性 RNAi 経路を利用し、疾患関連遺伝子の明確な減少を可能にし、相関関係を持つあらゆる遺伝子に適応するため、天然の効力があります。siRNA 介入による疾患治療の基礎として、疾患の遺伝的性質が強力なサポートを提供します。実際、主要な癌遺伝子、発癌に関連するウイルス性癌遺伝子、または悪性腫瘍を標的とする癌遺伝子を標的とするさまざまな siRNA が設計されています。
機構：
RNAi の最初のステップでは、長い二重結合 RNA を siRNA に処理および切断します。siRNA は通常、各鎖の 3' 末端に 2 ヌクレオチドの突出を持ちます。この処理を担うタンパク質は、ダイサーと呼ばれる RNase III のような触媒です。siRNA は、形成されると、RISC (RNA 誘導ハッシュ コンプレックス) と呼ばれる多タンパク質複合体によって制限されます。RISC コンプレックス内では、siRNA 鎖が分離され、より安定した 5' 末端を持つ鎖が通常、活性 RISC コンプレックスに組み込まれます。アンチセンス単一結合 siRNA コンプレックスは、次に、標的 mRNA 上で RISC コンプレックスを制御および調整し、アルゴノート ファミリー (Ago2) の 1 つである相乗 RISC タンパク質の活性によって、mRNA が切断されます。
方法:
NISV は、脂質ベースのナノ粒子を調製するために最近開発された技術であるマイクロ流体混合によって構築され、治療オペレーターの効果的な例である小さな小胞の生成をもたらします。NISV を準備するために、NISV 成分の各ストック配列から特定の量を混合して脂質層を構築しました。脂質層はマイクロ流体マイクロミキサーのメインの湾に注入され、液体層は 2 番目の湾に注入され、混合温度は 50°C に設定されました。水層と天然層の間の流量比 (FRR) は 3:1 に設定され、2 つの層の総流量 (TFR) は 12 ml/分に設定されました。これにより、高流量で、脂質の段階的進行を超える温度で、2 つの層間の迅速な混合が可能になります。次に、流出ストリームから散乱物を収集し、計画の最終エタノール含有量を 6.25% (v/v) に減らすように急速に希釈しました。 NISV の細胞毒性評価は、非小細胞肺癌細胞 (A549) およびマウス黒色腫細胞 (B16-F10-LUC) で実施されました。copGFP-A549 細胞では緑色蛍光タンパク質 (GFP) を標的とする siRNA、B16-F10-LUC 細胞ではルシフェラーゼを標的とする siRNA が NISV で検出されました。NISV を使用して送達された抗 GFP siRNA (siGFP) による GFP の発現抑制は、フローサイトメトリー、ポリメラーゼ連鎖反応、およびウェスタンブロット法により評価されました。黒色腫を標的とするルシフェラーゼを誘導する B16-F10-LUC 細胞でワクチン接種された裸の BALB/c マウスを使用して、NISV の in vivo での siRNA 送達能力を評価しました。
結果：
細胞毒性試験では、NISV は 40 µg/ml 以下では無害であることが示されました。NISV 溶液は高い siRNA 標識効率を示しました。蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリー試験では、細胞に取り込まれなかった裸の siRNA と比較して、細胞による高い細胞取り込みが示されました。NISV は、siGFP を細胞に送達し、GFP の発現を完全に抑制することができました。これらの結果は、ルシフェラーゼ産生 B16-F10-LUC 細胞に抗ルシフェラーゼ siRNA (siLUC) をトランスフェクトすることによって確認されました。ルシフェラーゼ タンパク質測定システムを使用して siLUC トランスフェクション後のルシフェラーゼ発現レベルを評価すると、ルシフェラーゼ発現の抑制が効果的に示されました。次に、裸の BALB/c マウスを使用して NISV を in vivo テストに使用しました。腫瘍内注入後、siLUC は細胞に送達され、siLUC を投与されたマウスよりも大幅に高いレベルでルシフェラーゼの発現を阻害しました。これらの生体内結果は、NISV が siRNA を標的細胞の細胞質に効果的に送達し、標的タンパク質を阻害する能力を証明しています。
結論：
NISV は、siRNA の送達システムとして使用できる可能性があることが広く実証されています。これらの結果は、NISV が siRNA ベースの治療における低い安定性や細胞への取り込みの悪さなどの障害を克服するために使用できることを示しています。